线粒体是在所有真核细胞中发现的膜结合细胞器。它们通常被称为细胞的能量库。他们的主要功能是产生各种细胞过程所必需的ATP，包括新陈代谢、生长和运动。功能障碍

线粒体与线粒体疾病相关，包括肌肉无力、疲劳、代谢性中风、癫痫发作、心肌病、，心律失常、发育或认知障碍、糖尿病等。线粒体DNA提取KIT提供了一种简单、快速和用于在不受基因组DNA污染的情况下从各种细胞和组织类型中分离完整线粒体DNA的可靠工具。这个回收的线粒体DNA与各种下游应用兼容，包括聚合酶链式反应、克隆等。

Mitochondrial DNA Isolation Kit ：

目录编号 PI-0105

规格：50份准备

样本类型：细胞和组织

检测类型：定性

应用：从多种细胞和组织类型中分离出未受基因组DNA污染的完整线粒体DNA。

储存条件：-20°C

运输温度：冰袋

保质期：自交货日期起一年

储存和操作：

- 未开封的试剂盒应存放在-20°C。使用前需将其放置至室温。使用时，将所有缓冲液置于冰上并保持在冰上。

- 提取缓冲液：按供应状态直接使用。存放在4°C。

- 线粒体裂解缓冲液：按供应状态直接使用。存放在4°C。

- 蛋白酶K：用275微升的Tris-EDTA缓冲液复溶。分成方便的小份，并立即在-80ºC重新冷冻。

- Tris-EDTA缓冲液：按供应状态直接使用。存放在4°C。

分离协议：

1. 将所有材料和缓冲液预冷至0-4°C。确保水浴温度为50°C。

2. 将5-10×10^6个培养细胞以300×g的速度离心3分钟，温度保持在4ºC，以沉淀细胞。小心移除培养基。

3. 用冰冷的PBS洗细胞，然后以300×g的速度在4ºC下离心5分钟。移除上清液。

4. 将细胞在冰上用1.0 ml冰冷的提取缓冲液重悬。放置在冰上10分钟。

5. 使用冰冷的Dounce组织研磨器和松散的研棒，在冰上对细胞进行均质化处理，使用50-100次通过组织研磨器。注意：有效的均质化取决于细胞类型。为了检查均质化效率，在显微镜下观察2-3 µl均质化悬浮液在盖玻片上的形态。细胞核周围的光泽环表明细胞仍然完整。如果有75%的细胞核没有光泽环，则均质化已足够，可以进行下一步。如果没有，使用Dounce均质器再进行30-50次通过。也应该避免过度均质化，因为它会损坏线粒体。

6. 将匀浆液转移到1.5 ml微量离心管中。以1200×g的速度在4ºC下离心10分钟，以沉淀细胞核和细胞碎片。

7. 小心地将上清液转移到一个新的1.5 ml微量离心管中，然后以13,000×g的速度在4ºC下离心15分钟。

8. 将上清液转移到一个新的管中。以10,000×g的速度在4°C下离心30分钟。丢弃上清液。

9. 在1 ml提取缓冲液中重悬沉淀物。以10,000×g的速度在4ºC下离心30分钟。丢弃上清液。

10. 此时的沉淀物是分离出的线粒体。

11. 在冰上向沉淀物中加入30 µl线粒体裂解缓冲液，混合并在冰上放置10分钟以裂解分离出的线粒体。

12. 加入5 µl的蛋白酶K，在50ºC的水浴中孵化1-2小时，每30分钟检查一次，直到溶液变清。

13. 加入100 µl J对乙醇，涡旋混合后放置在-20ºC的冰柜中10分钟。

14. 以16,000×g的速度在室温下离心5分钟。

15. 移除上清液。沉淀物是线粒体DNA。

16. 通过加入1 ml 70%乙醇，混合后在室温下以13,000×g的速度离心1分钟，重复两次，来清洗线粒体DNA沉淀物。

17. 使用移液器吸头去除微量的乙醇。风干5分钟。注意：不要W全干燥DNA。如果W全干燥，它将很难溶解。

18. 在20 µl的Tris-EDTA缓冲液或水中重悬线粒体DNA。将提取的线粒体DNA存放在-20ºC。注意：每次分离可准备5-20 µg线粒体DNA。